qPCR复孔差距大，这些原因你排查了吗？

何为“Ct值”

qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。
扩增曲线：是qPCR反应过程中荧光信号随时间(或循环数)变化的直观展示。
基线期：稳定的荧光背景，反映了系统的非特异性荧光。
指数增长期：荧光信号急剧上升，是PCR扩增的主要阶段，也是Ct值计算的基础。
平台期：扩增速度放缓，荧光信号趋于稳定，表明反应接近尾声。
在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，以此作为“一定产物量”，并且由此来推断模板最初的含量。
Ct值是荧光定量PCR重要的结果呈现形式。它被用于计算基因表达量差异或者基因拷贝数。Ct值会受到阈值的影响，每次实验由于样品和仪器的不同会导致基线不同，进而影响Ct值和阈值。

Ct值合理范围

Ct值的范围为15-35。
Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。
Ct值过大
①原因：模板浓度低或存在PCR抑制物。
解决方案：提高模板浓度；或降低RNA或cDNA稀释比例；或重新制备模板。
②原因：扩增效率低
解决方案：降低退火温度，或选用二步法扩增；组分和体系充分混匀；优化反应程序；或尝试更换试剂。
③原因：引物设计不合理或引物失效
解决方案：重新设计引物
Ct值过小
①原因：模板浓度高
解决方案：减少模板RNA量；或更高比例稀释cDNA。
②原因：NTC和NRC存在污染
解决方案：重新更换所有试剂；或使用UDGase防污染试剂。
③原因：引物设计不合适
解决方案：优化程序，避免非特性扩增。

一般情况下，一个样本会设置三个复孔，最终该样本会得到3个Ct值。此时，使用excel表格内的公式：STDEV(x1,x2,x3)，就可以获得这三个Ct值的标准差，也就是SD值，SD小于0.5，则认为是可以接受的实验操作结果。SD越小，代表三个数值之间的差异越小，如果三个数值都一样，那它们的SD值就为0。
• SD<0.5，是可以接受的误差范围；
• SD越小，重复性越好。

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